- 蛋白质印迹法
在显影过程中，较为简单也是目前科研中最为常用的方法是ECL化学发光法，发表文章时大都也选择这种方法。ECL（electrochemiluminescence）是一种化学发光试剂，一般是Western blot实验中的最后一步，需要1：1混合溶液A和溶液B（一般使用的发光液A和B分别为鲁米诺和过氧化氢），混合液均匀覆盖PVDF膜，成像仪曝光后可显色观察实验结果。
鲁米诺是一种重要的化学发光试剂，它的氧化反应需要在碱性缓冲液中进行，在过氧化氢存在下形成激发态中间体，当回到基态时发光，波长为425nm。早期是使用鲁米诺直接标记抗原/抗体，但近年来已改用过氧化物酶标记抗体，以鲁米诺作为发光底物，Kodak Am erliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。
ECL化学发光法检测辣根过氧化酶（HRP）的原理如下：辣根过氧化物酶在过氧化氢存在的条件下，氧化化学发光底物鲁米诺并产生激发光，在化学增强剂的作用下，光信号可被放大数千倍，随后采用X胶片或成像仪检测即可。ECL方法的特点为操作简便、灵敏度高、线性范围广等。
- Western Blot常见问题及解决方法
| 原因分析 | 推荐解决方法 |
| 转膜的效率低 | 用预染色分子量标准来判断，提高转膜效率 |
| 抗原/抗体量少或不匹配 | 增加抗原/抗体量或选择合适抗原/抗体 |
| X光胶片有问题 | X光片洗片以后应当为透明的胶片，如果全黑则说明 已经完全曝光了，应当废弃 |
| 定显影液有问题 | 可以先曝光一张胶片来验证，若有问题及时更换新 的定显影液 |
| 反应系统中HRP量过多 | 稀释HRP标记物 |
问题2：X 光胶片背景脏， 或者出现“一片黑”
| 原因分析 | 推荐解决方法 |
| 一抗、二抗浓度太高 | 降低抗体浓度，延长封闭时间；或将ECL工作液用去 离子水稀释2-5倍后使用 |
| 抗体未清洗干净 | 增加洗膜次数 |
问题3：条带有空斑
| 原因分析 | 推荐解决方法 |
| 转膜时有气泡 | 在搭建“三明治”结构时尽量驱赶气泡 |
| 转印膜没有水化均匀 | 充分激活转印膜 |
问题4：带型不规则
| 原因分析 | 推荐解决方法 |
| SDS-PAGE凝胶配制不均 | 充分混匀后再进行灌胶制胶 |
| 跑胶时电压不稳 | 确认电泳槽两级接触正常以及跑胶时保存静置 |
- Biodragon增强型ECL化学发光试剂盒
产品基于鲁米诺底物的化学发光试剂盒，能够被辣根过氧化物酶（HRP）催化，发 出强烈辉光，检测灵敏度达到 pg 级。本试剂盒优化了底物组成，使用了新型高效增强剂， 发光强度比传统 ECL 显色液提高了 30-100 倍，并有效地降低了背景。试剂盒使用新的氧化 剂代替不稳定的H2O2，提高了试剂盒的稳定性，室温可稳定放置 1 年。工作液被 HRP 催化后，发出特定波长荧光（400-450nm），可对 X 光胶片曝光，也可直接使用荧光 CCD 扫描， 主要应用于 Western 检测以及化学发光免疫检测系统。 超敏型的灵敏度比增强型高 10 倍以上（见下图），对于增强型无法检测的微量样品，可以选择超敏型。
2、溶液配制
（1）一抗工作浓度：0.2-1.0 μg/ml；
（2） HRP 标记二抗工作浓度：10-500 ng/ml，根据二抗效价调整。
（3） 发光检测工作液的配制：Solution I : Solution II = 1:1（10 cm2 转印膜使用 1-2 ml 工作液）
抗体去除液（用于膜的再生）
基本型：0.1M 甘氨酸，HCl 调整 pH 至 2.7
传统型：2% SDS, 0.1M mercaptoethanol, 50mM Tris-HCl, pH 7.0
高效型：6M GuHCl, 0.2% Nonidet P-40 (NP-40), 0.1M β-mercaptoethanol, 20mM Tris-HCl, pH7.5
3、操作步骤
根据常规操作转印结束后，进行封闭、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步骤，根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积溶液 I 和溶液 II 混匀，配制成发光检测工作液。用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均匀覆盖，室温孵育 1-2 分钟，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
3.1 X 光胶片法
（1）用平头镊子夹起转印膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工 作液，不要让膜完全干燥。膜的蛋白面朝上，包裹于洁净保鲜膜内。轻轻赶出其间的气 泡，用小块透明胶带粘住四角，固定在 X 光片暗盒内。
（2）在暗室中取一张 X 光胶片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光 30 秒至 1 分钟。立即定影、显影，根据曝光强度，调整下一张 X 光胶片的曝光时间。如果背景过高，可以使用两 张 X 光胶片同时压片。
3.2 荧光拍照法
（1）如果需要使用 CCD 拍照，可以将膜放置于工作液中，开机后按照使用说明，将转印膜 取出，进行拍照。
（2）可以根据背景情况，调整机器测量参数，提高信噪比。
3.3 管式化学发光法
（1）将鲁米诺的化学辉光检测波长可设定在 420 nm 左右，可以选择单点测量，或者取多次平均值。
（2）按照机器要求，将配制好的工作液加入到样品管中，间隔一定时间测量发光强度，注意鲁米诺系统的发光到达峰值有一定延迟（30-300 秒），不同样本的测量时间间隔要固定。
（3）HRP 催化鲁米诺发光的体系还受到反应温度以及 pH 的强烈影响，所以工作试剂准备以及发光测量需要考虑到此类因素。
| 货号（丁香通链接） | 名称（官网链接） |
| BF06053-250 | 增强型ECl化学发光试剂盒 |
| BF06053-500 | 增强型ECl化学发光试剂盒 |
| BF06053S-250 | 超敏型ECl化学发光试剂盒 |
| BF06053S-500 | 超敏型ECl化学发光试剂盒 |
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| 名称 | 货号 | 规格 | 价格 |
| Western Blot膜再生液 | BF06019 | 100ml | 160 |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | BTYA0301-500T | 500T | 360 |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | BTYA0301-200T | 200T | 200 |
| SDS-PAGE凝胶制备试剂盒6% | BTYA0306 | 50T | 320 |
| SDS-PAGE凝胶制备试剂盒8% | BTYA0307 | 50T | 320 |
| SDS-PAGE凝胶制备试剂盒10% | BTYA0308 | 50T | 320 |
| SDS-PAGE凝胶制备试剂盒12% | BTYA0309 | 50T | 320 |
| SDS-PAGE凝胶制备试剂盒15% | BTYA0310 | 50T | 320 |
| 30%Acr-Bis 29:1 | BTYA0311 | 500ml | 160 |
| 30%Acr-Bis 37.5:1 | BTYA0312 | 500ml | 240 |
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