IF=9.5 |DOI: 10.1073/pnas.1821116116
Protein phosphatase 2A has an essential role in promoting thymocyte survival during selection
2019年5月31日，美国科学院院刊PNAS在在线发表了浙江大学医学院免疫学研究所鲁林荣教授课题组与南京大学高翔教授课题组合作的最新研究成果 “Protein phosphatase 2A has an essential role in promoting thymocyte survival during selection”，该研究揭示了磷酸酶PP2A在调控胸腺T细胞存活和细胞选择中的关键调控作用。
其中，由中科新生命提供的定量磷酸化组学服务，为该研究的机制探索提供了数据基础。
磷酸酶PP2A及其介导的去磷酸化在维持胸腺T细胞存活过程中的作用
研究背景：
T细胞在胸腺发育的过程中，只有少数细胞表面表达的T细胞受体（T cell receptor，TCR）能与自身MHC-多肽以中低亲和力结合的CD4+ CD8+双阳性（double positive, DP）T细胞能存活下来，并进一步发育成单阳性CD4+ 或CD8+ T细胞，释放到外周发挥免疫保护作用。目前，一般认为TCR激活能通过诱导Bcl-2家族抗凋亡蛋白的表达来维持细胞的存活，然而，这些细胞在接受TCR信号后如何能促使细胞存活的具体机制仍然不完全明了。
研究材料：
野生型小鼠(WT mice)、条件敲除型小鼠（PP2Ac cKO mice）
研究结果：
1. 磷酸化修饰组：磷酸化修饰在T细胞成熟过程中的变化，并构建去磷酸酶PP2A条件敲除型小鼠。
为了探究T细胞在胸腺发育过程中的磷酸化调控作用，首先通过anti-CD3刺激野生型鼠的胸腺细胞，模拟DP细胞发育成熟的过程，随后利用iTRAQ磷酸化修饰组, 分析刺激后的磷酸化修饰变化。修饰组共发现了超过4000个磷酸化修饰位点，然而差异变化显示，该过程中并没有模型的整体磷酸化上调变化，而是上调与下调的磷酸化位点数目相当，其中， 27个蛋白磷酸化差异超1.5倍，30个磷酸化蛋白显示相似的去磷酸化程度变化 (图1.A)。因此，该发现表明，该T细胞在胸腺发育过程中磷酸化与去磷酸化可能发挥了同样重要的作用。
进一步，作者将关注点放在去磷酸化差异大的五个蛋白上，发现其中两个蛋白TOP2与Smarca4已经被报道过，它们上游的去磷酸酶为PP2A。由此推测，PP2A很可能在DP细胞发育过程中发挥重要功能。为了证明该推测，作者构建了敲除型小鼠，为了避免胚胎致死，该小鼠为T细胞特异性的PP2A条件敲除（conditional knockout, cKO）。随后再次通过刺激处理，并进行磷酸化修饰组学分析，探究修饰差异变化的蛋白。研究表明（图1.B），在PP2A cKO细胞中，刺激后共有370个蛋白发生磷酸化变化，发生1.75倍的磷酸化上调的蛋白有35个，而其中有6个蛋白与细胞存活相关，比如LSP1和DAXX等蛋白的磷酸化已知与细胞对凋亡诱导的敏感性相关，该结果提示，PP2A很可能通过去磷酸化介导的凋亡通路调控来保证细胞存活。
图1.磷酸化修饰组分析
2. 验证：PP2A敲除型小鼠中，胸腺发育异常，同时发育成熟的外周T细胞数目减少。
利用表型实验，作者进一步表明了PP2A确实在T细胞的胸腺发育过程中发挥重要作用。结果显示，在胸腺发育过程中（图2），PP2A敲除后小鼠的胸腺尺寸明显变小，同时CD4-CD8-双阴性细胞（double negative，DN）的百分比增加，且CD4+CD8+ DP的 T细胞显着减少。外周 T细胞检测表明（图3），PP2A敲除小鼠的脾脏、淋巴结中的CD4+ T细胞、CD8+ T细胞数目减少。
图2.PP2Ac缺失致T细胞发育缺陷
图3. PP2Ac缺失致外周T细胞数目降低
3. 机制探究：PP2A敲除型小鼠中，胸腺细胞的存活受损。
为了确定胸腺细胞发育受损可能是由TCR信号通路受损引起的，作者分析了TCR下游的信号通路变化，然而未发现信号通路中关键因子（PLC-γ1, AKT, Erk1/2, and Jnk）的磷酸化变化。此外，增殖实验也表明，PP2A缺失没有影响胸腺细胞的增殖能力。因此，该研究表明PP2A既不是通过改变TCR信号通路、也不是通过影响胸腺细胞增殖而引起胸腺发育受损的。
接下来，利用细胞存活实验（图4），作者发现PP2A敲除后, DP细胞存活能力受到影响，凋亡明显增加。研究表明， PP2Ac缺失导致DP胸腺细胞凋亡显着增加，同时caspase-3活性增强。在TNF-α或Fas-L刺激后，在PP2Ac cKO细胞中也观察到DP胸腺细胞的凋亡增加。
图4. PP2Ac缺失致胸腺细胞存活受损
4. 机制验证：Bcl2转基因表达或p53敲除回复了PP2A cKO小鼠中胸腺细胞的发育缺陷。
最后， 为了确定损伤的胸腺细胞发育是否能够通过增强细胞存活得以回复（图5），作者利用表达抗凋亡基因的Bcl2转基因小鼠与PP2A cKO小鼠杂交，以及利用促凋亡基因p53敲除小鼠与PP2A cKO小鼠杂交，结果均发现，PP2Ac缺陷小鼠中，胸腺细胞水平下降很大程度上得以回复。因此，该结果表明PP2A是通过促进细胞存活，保证胸腺细胞发育为成熟T细胞。
图5. Bcl2转基因鼠能回复细胞凋亡缺陷.
小编总结：
本研究揭示了PP2A介导的蛋白去磷酸化在维持胸腺细胞存活、T细胞选择中的关键调控作用，而磷酸化修饰组分析，为后续的机制探究提供了极为重要的指导作用。磷酸化组分析发现，差异磷酸化蛋白（LSP1和DAXX等）的磷酸化已知与细胞对凋亡诱导的敏感性相关，这将PP2A缺失引起的胸腺发育受损原因指向了与细胞凋亡相关的过程中，使得后续的探究实验建立在这个方向上。因此，修饰组学可以说是帮助我们去挖掘机制的重要手段之一。
最后，中科新生命祝贺浙江大学鲁林荣教授文章被高水平杂志接收，同时也由衷欣喜我们提供的磷酸化组服务，为老师取得丰硕成果助一份力。
中科新生命一直秉承专“新”致“质”的宗旨，以往在磷酸化组研究方向上，已有多篇合作文献，如下（部分）：
客户文献1： Cell Research: The novel quantitative trait locus GL3.1 controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1;3
客户文献2：Molecular & Cellular Proteomics: Quantitative Phosphoproteomic and Metabonomic Analyses Reveal GmMYB173 Optimizes Flavonoid Metabolism in Soybean under Salt Stress.
客户文献3：Molecular & Cellular Proteomics：Mechanisms of soybean roots' tolerances to salinity revealed by proteomic and phosphoproteomic comparisons between two cultivars.
关于中科新生命的修饰组学服务：
1. 基于国内顶尖的蛋白质组服务平台，业内率先推出修饰组学分析服务
2. 采用金标材料富集修饰肽段
3. 合作文章发表：国内率先+数量**的磷酸化、泛素化组代表文章