NAT COMMUN（IF17.694）｜南京医科大学附属儿童医院团队发现DNA-PKcs有望成为慢性肾脏病治疗新靶点！
慢性肾脏疾病(CKD)困扰着全世界10%的成年人，目前尚无有效的治疗方法，肾间质纤维化是该病的主要病理特征之一。新近的研究表明，肾损伤引起肾细胞发生代谢重编程，主要表现为肾小管上皮细胞去分化和肌成纤维细胞激活，这种代谢重编程促进免疫细胞浸润和间质纤维化，并促进CKD的发展。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的慢性激活可促进各种病理条件下的代谢重编程，但其调节间质纤维化激活的机制在很大程度上仍然未知。 2023年3月11日，南京医科大学附属儿童医院张跃/黄松明/贾占军/张爱华团队在Nature Communications (IF 17.694)发表题为“DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) drives chronic kidney disease progression in male mice”的文章。 在这项研究中，研究人员发现在慢性肾脏病（CKD）患者以及雄性小鼠单侧输尿管梗阻（UUO）和单侧缺血再灌注（UIR）损伤诱导的肾脏组织中DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基DNA-PKcs的表达均显著升高，体内外抑制DNA-PKcs可纠正CKD中受损上皮细胞和肌成纤维细胞的代谢重编程。机制上，DNA-PKcs在CKD中通过磷酸化TATA-box结合蛋白相关因子7 (TAF7)介导RAPTOR/mTORC1信号的激活。因此，在CKD中可以通过TAF7/ mTORC1信号通路抑制DNA-PKcs以纠正代谢重编程，并作为治疗CKD的潜在靶点。 基因信息 DNA依赖性蛋白激酶催化亚基， 病毒产品 AAV8-U6-gRNA-DNA-PKcs； AAV8-U6-gRNA 实验动物 6-8周龄雄性Kap+Cas9+小鼠 病毒用量 5×10E11 GC 注射方式 肾包膜下注射 
DNA-PKcs
1 研究结果
1、DNA-PKcs介导小鼠CKD进展
实验验证DNA-PKcs在CKD患者和肾纤维化小鼠的肾脏中表达上调。作者构建了DNA-PKcs敲除小鼠，并给予小鼠UUO处理，与WT小鼠相比，DNA-PKcs的敲除明显改善了UUO诱导的肾小管结构障碍及肾纤维化，同时显著降低UUO诱导的炎性细胞因子上调。UUO造成了WT小鼠梗阻肾内巨噬细胞的大量浸润，而DNA-PKcs敲除后巨噬细胞浸润明显减少。接着，作者将靶向DNA-PKcs的AAV8-sgRNA以肾包膜下注射的方式注入Kap+ Cas9+ 小鼠肾脏，进一步构建了近端肾小管上皮细胞DNA-PKcs特异性敲除小鼠（DNA-PKcsTEC KO），3周后进行UUO手术，Western blot分析显示，DNA-PKcsTEC KO小鼠肾脏中DNA-PKcs和促纤维化标志物蛋白水平显著降低。与UUO模型类似，DNA-PKcs敲除小鼠也能免受UIR诱导的CKD。这些结果表明，DNA-PKcs缺失可以减弱小鼠CKD进展。
图1. DNA-PKcs缺失减弱了小鼠CKD进展
2、体内给药DNA-PKcs抑制剂NU7441可减弱小鼠CKD进展
基于上述结果，作者假设DNA-PKcs抑制剂可以用于预防肾纤维化。对进行UUO手术的WT小鼠每天给予DNA-PKcs高特异性抑制剂NU7441治疗，免疫组化染色分析显示NU7441的给药显著抑制UUO肾组织DNA-PKcs的激活，并且NU7441处理后UUO诱导的肾小管结构障碍和肾间质纤维化均得到明显改善；与对照相比，NU7441处理后UUO小鼠肾组织巨噬细胞浸润也显著减少。此外，作者发现NU7441在DNA-PKcs敲除小鼠中没有明显的抗纤维化作用，表明NU7441对DNA-PKcs具有特异性作用。同样地，NU7441治疗也能改善UIR诱导的肾损伤和纤维化。这些结果表明，NU7441抑制DNA-PKcs活性，可以减弱小鼠CKD进展。
图2. DNA-PKcs抑制剂NU7441的处理可减弱小鼠CKD进展
3、体外抑制DNA-PKcs活性可保护肾小管上皮细胞表型，调节间质成纤维细胞激活
肾损伤会引起肾小管上皮细胞去分化和肌成纤维细胞激活，这是CKD发病机制中的核心事件。TGF-β1是间质纤维化的关键介导因子，作者发现在TGF-β1处理的HK-2细胞中，DNA-PKcs磷酸化水平和总蛋白水平显著上调，进一步研究表明，敲除DNA-PKcs或添加NU7441抑制剂均可以改善TGF-β1诱导的肾上皮细胞去分化。不仅如此，TGF-β1处理也上调了肾成纤维细胞（NRK-49F）中的DNA-PKcs磷酸化和总蛋白水平。免疫染色显示，在NRK-49F细胞中，TGF-β1处理显著诱导DNA-PKcs活性，促进成纤维细胞激活和肌成纤维细胞分化，而NU7441处理则得到了与之相反的结果。这些数据表明，抑制DNA-PKcs可以保护肾小管上皮细胞表型，并调节间质成纤维细胞激活。
图3. 体外抑制DNA-PKcs可以保护肾小管上皮细胞表型，调节间质成纤维细胞激活
4、DNA-PKcs通过TAF7介导的RAPTOR表达上调促进mTORC1的激活
作者证实DNA-PK通过介导TAF7磷酸化加重肾纤维化，为了进一步探讨TAF7的促纤维化作用机制，研究人员进行了RNA-Seq。相关分析表明，TGF-β1处理后mTOR信号通路显著上调，而TAF7敲除后mTOR信号通路则明显下调。同时，TGF-β1处理还增加了mPTC细胞中mTORC1磷酸化水平及其正调节因子RPTOR (RAPTOR)的蛋白水平，而敲除TAF7后则与之相反。此外，作者发现无论是过表达DNA-PKcs还是TAF7，RPTOR蛋白水平和mTOR磷酸化水平均升高。这些结果表明DNA-PKcs介导的TAF7磷酸化通过上调RPTOR的表达来促进mTORC1的激活。
图4. DNA-PKcs通过TAF7介导的RAPTOR表达上调促进mTORC1的激活
5、抑制DNA-PK或TAF7可以纠正肾细胞代谢重编程
先前的研究表明，mTORC1的异常激活通过介导纤维化肾的代谢重编程促进肾纤维化的进展，因此作者研究了抑制DNA-PK或TAF7是否能纠正纤维化肾脏的代谢重编程。通过对TGF-β1处理的NC和TAF−/−mPTC细胞进行RNA-Seq分析，作者发现代谢信号通路是两种mPTC细胞之间表达差异最大的通路之一。与NC对照细胞相比，TAF7敲除mPTC细胞经TGF-β1处理后氧化磷酸化和脂肪酸氧化途径显著上调，糖酵解途径显著减少，表明TAF7缺失可以纠正TGF-β1诱导的mPTC细胞代谢重编程。另一方面，敲除DNA-PKcs可明显改善UUO诱导的WT小鼠氧化磷酸化和脂肪酸代谢异常，并抑制糖酵解途径。最后，使用代谢组学分析进一步说明抑制DNA-PK或TAF7可以纠正由损伤或TGF-β1引起的肾细胞代谢重编程。
图5. 抑制DNA-PK或TAF7可以纠正代谢重编程
2 结论
本研究发现DNA-PKcs通过磷酸化TAF7介导RAPTOR/mTORC1信号的激活，并纠正受损上皮细胞和肌成纤维细胞的代谢重编程，表明靶向DNA-PKcs可能是治疗慢性肾脏疾病的潜在治疗策略。
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