1.CAEN可以保护和稳定PPE蛋白的活性

2.CAEN可以特异性切割CD95促进肿瘤细胞凋亡

在由H57、D102、S195和S214组成的PPE的活性中心周围，Mn²⁺而不是Ca²⁺与D60和D97相互作用（图3A，B）。此外，Mn²⁺与PPE蛋白能够相互结合。将Mn²⁺和PPE的蛋白质复合体结构与PPE和小分子抑制剂的蛋白质复合体结构进行比较（图3C），Mn²⁺改变了PPE蛋白的结构，与蛋白质印迹实验中白蛋白对非特异性条带的阻断作用相似。为了验证不同制备组对CD95的切割能力，纯化MBP-CD95蛋白并对其进行切割实验（图3E-G）。MBP-CD95(200-335)的理论分子量为58.3kD（图3D）。将不同的制剂组与MBP-CD95蛋白孵育30min（图3E）。CAEN组和PPE蛋白组均能有效地切割MBP-CD95，但PPE组切割MBP-CD95，而CAEN组仅选择性切割CD95蛋白。为了测试CAEN在肿瘤细胞内切割CD95的能力，进行了不同剂型(PBS、PPE、NP或CAEN)处理MDA-MB-231细胞和A549细胞的蛋白质印迹实验。CAEN治疗组较其他对照组有较深的条带，证实了CAEN有效切割CD95蛋白的能力（图S14）。CAEN治疗组肿瘤细胞发生凋亡的比例最为显著（图3F,G），表明CAEN具有诱导细胞凋亡的能力。与PBS和PPE组相比，CAEN组与肿瘤细胞孵育6h后细胞内活性氧(ROS)水平显著升高，CAEN组大鼠心肌细胞线粒体膜电位明显降低，细胞内线粒体功能受损（图3H）。在蛋白质水平上进一步测定了不同处理组B16-F10细胞的凋亡指数（图3I）。

3.CAEN可提高输送效率和肺滞留时间

将B16-F10与CAEN-FITC共孵育4h后，绿色荧光弥散在肿瘤细胞的胞浆中，表明CAEN能有效和快速地被肿瘤细胞吸收（图4A）。为验证气雾剂的成功给药，使用考马斯亮蓝溶液(CBB)作为指示剂证明药物可以有效地进入小鼠的肺组织。小鼠肺组织中有大量CBB溶液，主要分布在气管和支气管（图4B）。使用肺雾化喷雾给小鼠注射该药物来研究CAEN的保留情况（图4C）。使用Cy7荧光染料标记的PPE进行肺喷雾给药，荧光成像结果显示CAEN-Cy7处理的肺组织中荧光分布更强、更深，表明矿化纳米颗粒作为载体具有良好的穿透和保留能力（图4D、E）。

4. CAEN体内释放对肿瘤生长的抑制作用

为验证CAEN的抗肿瘤作用，将B16-F10细胞经尾静脉注入C57BL/6小鼠，形成局部抗肿瘤治疗的肺癌模型（图5A）。分别于第5、13、21天解剖小鼠，收集肺组织。随后，计数小鼠肺组织中的转移灶。如图5B、C所示，CAEN组在抗肿瘤治疗期间保持了良好的疗效，没有明显的转移。在治疗期间，小鼠的体重没有显著变化（图5D）。心、肝、脾、肺和肾等主要器官的染色结果表明，CAEN并未引起这些器官明显的病理变化（图5E）。肿瘤组织HE染色显示，CAEN组小鼠组织切片中癌细胞较少，而PBS组和PPE组肿瘤细胞数量较多（图5F）。对健康小鼠进行相同处理后，发现PPE治疗组对健康小鼠肺组织造成炎性损伤，CAEN治疗组和PBS治疗组无明显变化（图5G）。如图5H-K所示，TUNEL染色证实CAEN有效地诱导了细胞凋亡，且CAEN组CD8⁺T细胞比例在所有治疗组中最高。免疫组织化学染色结果显示，CAEN能显著减少肿瘤组织中Ki67⁺细胞的数量，有效抑制了肿瘤细胞的增殖（图S19）。

5. CAEN具有良好的生物安全性

CAEN对心、肝、肾功能无明显影响（图6A-C）。相比之下，PPE组各项指标均升高，且有一定毒性。血液学分析显示，包括PBS、PPE或CAEN在内的不同治疗组小鼠的红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板(PLT)水平保持在正常范围内（见图6D-F）。