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核糖核酸酶（RNase）是非常稳定、活跃的酶，它们通常不需要辅因子就能发挥功能。由于核糖核酸酶难以失活，并且很小的量就足以破坏RNA分子，因此在没有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情况下，不要使用任何塑料或者玻璃器皿。处理RNA时应非常小心，以避免在纯化的过程中或者纯化之后，将核糖核酸酶无意的引入到RNA样品中。为了创造并维持没有核糖核酸酶的环境，在预处理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液处理RNA时，一定要采取以下预防措施。 常规操作 处理RNA时，一定要使用合适的微生物学的无菌技术。手和灰尘颗粒可能会携带细菌和霉菌，是最常见的核糖核酸酶污染源。为了阻止来源于皮肤表面或者实验室器械灰尘上的核糖核酸酶污染，在操纵试剂以及RNA样品的时候，一直要佩戴乳胶手套或者乙烯基手套（PVC手套）。可能的情况下，要经常更换手套，并将试管处于关闭状态。当用移液管吸取溶液用于下游应用时，要将纯化过的RNA放在冰上。 为了去除工作台表面、非一次性塑料器皿和实验室器械（比如，移液管和电泳槽）上的核糖核酸酶污染，推荐使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常见的实验室试剂去除核糖核酸酶的污染。为了去除塑料器皿上的污染，使用0.1 M NaOH, 1 mM EDTA洗涤，然后使用去RNase的水洗涤；如果塑料器皿具有耐氯仿性，则可用氯仿洗涤。为了去除电泳槽的污染，可使用去污剂清洁（比如，0.5%的SDS），使用去RNase的水洗涤，然后用乙醇洗涤（如果电泳槽具有耐乙醇性），之后晾干。 重要：在使用化学试剂时，一定要穿戴合适的实验工作服，一次性的手套，以及具有护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书（SDS），了解更多信息。 一次性塑料耗材 在处理RNA的时候，推荐使用无菌的，一次性的聚丙烯管。这些试管通常没有核糖核酸酶，因此不需要预处理使核糖核酸酶失活。 非一次性的塑料耗材 非一次性的塑料耗材在使用之前应该进行处理，以确保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材应该严格的使用0.1 M NaOH、1 mM EDTA洗涤，然后用去RNase的水洗涤。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗涤，以使核糖核酸酶失活。 玻璃器皿 玻璃器皿在使用之前，应该进行处理，以确保其不含有核糖核酸酶。用于处理RNA的玻璃器皿在使用之前，应该使用去污剂清洁，严格的洗涤，并在240°C的烘箱中烘烤至少4小时（如果更方便的话，可以过夜）。也可以使用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC（0.1%的水溶液）充满玻璃器皿，在37°C的条件下过夜（12小时），然后使用高压釜处理或者加热到100°C 15分钟，以去除剩余的DEPC。 重要：在使用化学试剂时，一定要穿戴合适的实验工作服，一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的安全数据说明书（SDS），了解更多信息。 电泳槽 电泳槽应使用去污剂（比如，0.5%的SDS）清洁，严格的用去RNase的水洗涤，然后使用乙醇洗涤，之后晾干。 重要：在使用化学试剂时，一定要穿戴合适的实验工作服，一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商处提供的相应安全数据说明书（SDS），了解更多信息。 重要：一些电泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性，需要仔细查阅厂商说明书。 溶液 溶液（水或者其它溶液）应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂，它通过共价修饰RNase发挥作用。 重要：在使用化学试剂时，一定要穿戴合适的实验工作服，一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书（SDS），了解更多信息。 | |||||||||||||||||||||||||||
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溶液（水或者其它溶液）应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂。浓度为0.1%的DEPC经常用于处理玻璃或者塑料耗材，以使其表面的RNase失活，或者制备不含RNase的的溶液和水。DEPC通过共价修饰使RNase失活。在100 ml要处理的溶液中加入0.1 ml DEPC，大力的摇晃，以使DEPC充分进入溶液。将溶液在37°C的条件下孵育12个小时。在高压灭菌器内处理15 min以去除任何DEPC的痕迹。DEPC与伯胺发生反应，因此不能直接用于处理Tris缓冲液。在Tris缓冲液存在的条件下，DEPC非常不稳定，迅速分解为乙醇和CO2。在制备Tris缓冲液时，应先使用DEPC处理水，然后将Tris溶解以制备合适的缓冲液。痕量的DEPC会通过乙酰基化作用，与RNA分子中的嘌呤残基反应，将其修饰。在细胞外的环境中，乙酰基化的RNA分子以很低的效率被翻译。但是，除非有大量的嘌呤残基被修饰了，否则不会严重的影响这些RNA分子杂交形成DNA：RNA或者RNA：RNA杂交物的能力。溶液或者器皿上残留的DEPC，一定要在高压灭菌器中处理或者加热到100°C处理15 min，以便除去。 重要：在使用化学试剂时，一定要穿戴合适的实验工作服，一次性的手套以及护目镜。请参考产品厂商提供的相应安全数据说明书（SDS），了解更多信息。 | |||||||||||||||||||||||||||
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为了确保基因表达分析的精确性，所分析的RNA应能够准确地反映出其在生物样本中的体内表达情况。但实际在样本的操作和RNA的分离过程中，RNA很容易发生改变而使情况变得复杂。 生物样本一经提取，其中的RNA即变得极不稳定。期间所发生的人为影响主要分成两种。基因的下调和RNA的酶促降解会导致mRNA特异性或非特异地发生人为降低。同时在操作和加工样本的过程中，某些基因会被诱导表达。这两种效应的综合可能在检出的转录谱与体内真实情况之间造成偏差。 对RNA表达谱进行即刻的稳定化处理是精确基因表达分析中的首要事项。通常情况下，用于RNA分析的样本被迅速置于液氮中冷冻，在进一步处理之前一直储存于–80°C下。产品供应商也提供了一些稳定处理试剂，作为替代方法对生物样本中的RNA进行稳定化处理。这些供应商提供了集成化的样本处理溶液（套装），其中包括容器，稳定处理试剂及制备试剂盒
来自参考文献2。换算为核酸：RNA RNA分子量和摩尔换算
* mRNA平均长度为1930个核苷酸。 以上信息来源于QIAGEN 官网：http://www.qiagen.com/cn/resources/molecular-biology-methods/rna/ |
阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2015030007.html