非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是一种常见的健康问题，其患病率在全球范围内迅速增加。众所周知，包括遗传和环境因素在内的多种因素会导致 NAFLD 的发展。信号素是细胞外信号蛋白，信号素 7A (SEMA7A)是一种糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白；初步研究表征了SEMA7A 突变的小鼠的肝细胞出现水肿和脂肪变性，推测 SEMA7A 突变可能导致脂质代谢紊乱和 NAFLD 发展。
2022年8月，陆军军医大学第一附属医院（又名西南医院）柴进课题组在JCI insight （IF 9.484）上发表题为“SEMA7AR148W mutation promotes lipid accumulation and NAFLD progression via increased localization on the hepatocyte surface”的研究文章。本项目利用蛋白质组学和靶向代谢组学技术研究了Sema7aR145W 突变（相当于人类 SEMA7AR148W）造成小鼠肝脏的脂质沉积的分子机制，表明SEMA7AR148W 突变是 NAFLD 的重要的遗传决定因素，并通过增强蛋白激酶 C（PKC-α）信号传导引起小鼠肝内脂滴积聚。针对肝脏 中PKC-α 信号的靶向抑制，有望成为新的 NAFLD 疗法。中科新生命为其提供了TMT蛋白组学，脂质组学，靶向代谢组（中长链脂肪酸）检测的技术服务。
研究材料
NAFLD患者活检肝脏样本；野生型（WT），Sema7aR145W杂合子和纯合子小鼠肝脏
技术路线
步骤2：通过Sema7aR145W突变小鼠，进一步研究 SEMA7A 突变在 NAFLD中的作用；
步骤3：中长链脂肪酸检测发现纯合突变小鼠肝脏中FA和TG增加；
步骤4：蛋白质组学、qPCR和WB发现Sema7aR145W调控脂质合成关键基因与激酶；
步骤5：qPCR 和蛋白质印迹分析表明Sema7aR145W突变增加其在膜上表达，并激活肝细胞中的PKC-α信号传导。
研究结果
1. SEMA7A 杂合突变与NAFLD严重程度显著相关
为了探究SEMA7A 突变是否是NAFLD的潜在危险因素，研究人员分析了470 名 NAFLD患者，找出17名具有SEMA7A杂合突变的肝脏样本及13名配对的对照肝脏样本。肝脏组织学分析显示，具有 SEMA7A 杂合突变的 NAFLD 患者的脂肪变性和 NAS 的严重程度显著高于其匹配的对照组。
图1 伴或不伴 SEMA7A 杂合突变的配对 NAFLD 患者的基线特征
2. Sema7aR145W杂合突变小鼠的NAFLD严重程度和肝功能水平显著升高
为了进一步研究SEMA7A 突变在 NAFLD 进展中的功能作用，构建了Sema7aR145W（相当于人类 SEMA7AR148W）杂合子小鼠。在用高脂饮食 (HFD) 喂养 26 周后，我们发现杂合子小鼠的体重，肝脏重量和肝脏/体重比均显著高于对照组。组织学评估显示Sema7aR145W杂合子小鼠中的肝脂滴和NASs也显著增加。与对照组相比，肝脏TG，总胆固醇（Tch）以及血清ALT和AST的水平显著增加。因此，Sema7aR145W杂合子突变促进了小鼠NAFLD的进展。
图2 Sema7aR145W杂合子突变促进HFD喂养后小鼠NAFLD的进展
3. Sema7aR145W突变可增强小鼠肝脏中的FA和TG合成以及FA摄取
收集10 周龄的雄性 WT 和 Sema7aR145W 纯合子小鼠（每组 n = 4）的肝脏样本，通过中长链脂肪酸的靶向代谢组学和定量脂质组学分析表明，与对照组相比，Sema7aR145W纯合突变显著增加了小鼠肝脏 FA 和 TG聚积。
图3 靶向代谢组和脂质组学数据分析
接下来，标记定量蛋白质组学分析显示，在 5874 个定量蛋白质中，232 个蛋白被上调，260 个蛋白被下调。通过实时定量PCR (qPCR) 和蛋白质印迹分析表明，Sema7aR145W纯合突变上调了FA 和 TG 合成的关键基因（Acaca/Acc1、Fasn、Scd1、Gpat 和 Lipin2）、FA摄取基因（Cd36、Fatp5 和 Caveolin1）和 FA 分解代谢基因（Plin3、Plin5 和 Cpt1β）。这些数据表明 Sema7aR145W突变增强了小鼠肝脏 FA 和 TG 合成以及 FA 摄取。
图4 蛋白质组学鉴定结果、火山图和KEGG通路注释
图5 Sema7aR145W突变增加了小鼠肝脏中的FA和TG合成以及FA摄取
4. Sema7aR145W突变通过增强 PKC-α 信号传导，促进转录因子 Srebp1 和 Chrebp 以及核受体 Lxr 的表达，增强肝脏 FA 和 TG 合成和 FA 摄取
研究人员调研发现PKC-α 信号传导介导糖尿病大鼠的脂质代谢。通过蛋白表达分析，发现核受体Srebp1、Chrebp、Lxr及其靶基因 Acc1、Fasn、Scd1、Cd36 的表达和PKC-α 磷酸化水平，在 Sema7aR145W纯合子的肝脏和原代肝细胞中显著增加。这些发现表明，Sema7aR145W突变通过增加小鼠肝细胞中 PKC-α磷酸化，增强核 Srebp1、Chrebp 和 Lxr 表达，从而促进FA 和 TG 合成和 FA 摄取。
图6 关键因子的蛋白表达的相对水平的蛋白质印迹分析
5. Sema7aR145W突变增加其在细胞膜上表达，并激活肝细胞中的PKC-α信号传导
免疫荧光和免疫组织化学表明 Sema7aR145W纯合突变显著增加了肝细胞膜上的Sema7a蛋白。对小鼠原代肝细胞的膜蛋白进行检测显示，Sema7aR145W 纯合突变增加了膜上Sema7a 与其受体集成素 β1 蛋白结合，但与另一种 Sema7a 受体 plexin C1无关。通过抑制集成素 β1的表达，可显著降低 Sema7aR145W纯合小鼠原代肝细胞中 PKC-α 磷酸化水平以及 Sema7a 和 PKC-α 之间的相互作用，表明 Sema7aR145W突变通过其受体集成素 β1激活PKC-α信号通路。
图7 免疫荧光、免疫组化、免疫共沉淀分析结果
小结
综上所述，本文揭示了SEMA7AR148W突变导致脂质在肝细胞中积累的潜在机制。首先，SEMA7AR148W突变增加膜上的Sema7a蛋白，并与其受体集成素β1蛋白结合，增强肝细胞中的PKC-α磷酸化水平。其次，激活的PKC-α信号可增强转录因子SREBP1和ChREBP以及核受体LXR的表达，促进肝细胞中的FA和TG合成以及FA摄取，引起肝脏中脂滴的积累，导致NAFLD的发展。