杂交瘤细胞由能分泌特异性抗体的致敏B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合而成，再经次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的筛选及克隆化可以得到大量单克隆细胞株，能分泌针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。

杂交瘤单克隆抗体制备流程

利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般流程为：抗原制备、动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的选择性培养、杂交瘤细胞的筛选及克隆化、单克隆抗体的鉴定、杂交瘤细胞的冻存、单克隆抗体的大量生产、纯化。

杂交瘤单克隆抗体制备常见问题

1.HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理？

HAT选择性培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷。正常骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）缺陷型，不能够利用补偿途径合成DNA，而杂交瘤细胞具有B细胞的补偿途径，能在HAT培养基中存活增殖，因此用HAT培养基筛选杂交瘤细胞。

2.二次筛选有何意义？该怎么进行呢？

HAT培养基筛选的仅是杂交瘤细胞，在特异性方面可能存在差异，仅有少数是分泌预定特异性抗体的细胞，因此需要进行二次筛选。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含有一个或几个杂交瘤细胞，这些单细胞克隆生长，选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，在单克隆抗体制备过程中，需要经过两次原理和方法不同的筛选过程。

3.融合前，为何要进行骨髓瘤细胞的筛选？

融合前，应用含8-AG（即8-氮鸟嘌呤）的培养基对骨髓瘤细胞进行筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT活性。HGPRT是补偿途径嘌呤的主要合成酶，8-AG可以作为合成DNA的原料，但由于它是一种碱性细胞杀伤因子，对细胞有毒，其存在会使细胞死亡。而HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞不能通过补偿途径合成DNA，故可以存活，因而经8-AG筛选后的细胞都是HGPRT酶缺陷株。

4.克隆化的时间选择？

克隆化是为了获得产生预定抗体的单一细胞系，常用的方法为有限稀释法。克隆化应尽早进行并反复筛选，但也不宜过早，太早杂交瘤细胞性状不稳定，数量少且有丢失染色体的倾向；太晚各种细胞同时旺盛生长，互相争夺营养及空间，目的细胞可能被其他细胞淹没并淘汰。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时间培养后，可能会因细胞突变或染色体丢失，使部分细胞失去产生抗体的能力，所以需要进行多次克隆化。

5.细胞融合需要注意什么？

污染是融合实验最大的失败原因，干净的环境及适宜的无菌操作技术是融合成功的关键；技术上的误差也常常会导致融合失败。如供者淋巴细胞无免疫应答等。

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