重组腺相关病毒（recombinant Adeno-associated Virus, rAAV）在基因功能研究和基因治疗递送载体中占据主导地位，一直被认为是最安全的病毒载体之一。然而研究显示，在临床前研究和临床研究中，rAAV载体依然存在不同程度上的免疫反应，如诱导宿主免疫反应、活化B细胞产生针对病毒衣壳的中和抗体、激活细胞毒性T淋巴细胞反应等。在rAAV载体生产过程中残留的内毒素可能是导致宿主免疫反应的原因之一。
什么是内毒素？
内毒素(Endotoxin)：又称脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，由脂质A、菌体特异性多糖和非特异性核心多糖三部分构成，是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，单位EU/mL。内毒素对宿主是有毒性的，脂质A是内毒素的主要毒性组分。
图1 内毒素分子结构（紫色方框所示,图片来源参考文献4）
rAAV载体中为什么会含有内毒素？
内毒素的释放是由细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时造成的，也会发生在正常细胞生长和分裂过程中。在rAAV载体制备过程中，内毒素污染主要有两种来源：细菌内毒素和环境内毒素。由于rAAV生产所需要的质粒DNA是从大肠杆菌中分离提取的，因此质粒DNA可能含有少量内毒素；同时，rAAV制备过程中需转染293T细胞，而细胞的生长分裂可能也会带来内毒素的产生；此外，生产过程中的环境污染可能亦会引入内毒素。
rAAV载体中的内毒素如何检测？
根据药物生产的规范要求，基于鲎试剂的内毒素测定是检测内毒素残留的金标准。鲎是一种海洋节肢动物，身体呈青褐色，血液呈淡蓝色，鲎的血液一遇到细菌就会凝固。因此，人们利用这一特点开发出鲎试剂，即将鲎血液中的变形细胞进行溶解，将溶解物制成含有能被微量内毒素激活的凝固酶原产品，通过判断内毒素导致的浑浊效应测试内毒素含量。
通常，鲎试剂变性细胞溶液交联测定的敏感度是0.06个单位的内毒素EU/mL。测试样品用重蒸水两倍稀释使用，测定试剂（11uL）加入到rAAV溶液，培养在37℃，60min，试管检测胶块的出现，检测阳性和阴性结果。
内毒素对宿主的影响
内毒素对宿主是有毒性的，即使是少量的内毒素也可能会诱导宿主产生免疫反应。内毒素可以与细胞膜上的受体结合引起免疫反应，激活组织内的炎性细胞和炎症因子的释放，对细胞有较强的毒性作用，影响体内外细胞的生长和功能。在体内环境下，内毒素作用于哺乳动物，可导致机体发热，引发全身性炎症反应，继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰减等，最终导致死亡。因此，无论是涉及病毒载体的实验研究还是临床应用，我们都需要尽量去除载体的内毒素。
如何有效去除rAAV载体中内毒素
在病毒的生产中，内毒素的去除包括亲和层析、缓冲液洗涤等方法，亲和层析法去除内毒素具有耗时、成本高、载体回收率差等缺点。缓冲液洗涤法则是借助超滤或离子交换色谱分离LPS胶束，经过多次缓冲液交换洗涤，再用低速离心浓缩病毒培养液的方式去除rAAV载体内毒素，该方法目前在部分rAAV血清型中适用。无论哪种方法都有一定的局限性，因此，从源头上去除内毒素至关重要。
基于12年、30000+的病毒生产经验，和元生物持续优化病毒生产全流程，建立标准三级细胞库，每月更换细胞，保证代次，持续降低rAAV载体的内毒素；同时，我们选择GMP级的质粒完成病毒包装，从源头上控制内毒素的产生。在实际工作中，多次、随机检测的rAAV载体内毒素含量均＜10EU/ml，为研究者提供更好的基因载体，让基因递送触手可及。
和元生物具有丰富的rAAV包装经验，优化病毒生产全流程，制备的rAAV载体多次随机检测内毒素含量均＜10EU/ml，超出行业标准，满足临床前和临床研究需求。 和元生物制备的每一支病毒，在分装之前，都要经过十几道纯化工艺，才能保证病毒纯度！
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参考文献
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