生长素是植物生长发育的重要调节剂，它参与细胞发育过程、调节植物-环境相互作用、影响器官发育。生长素的转运主要由生长素外排和内流载体蛋白控制，在生长素外排过程中起重要作用的一种二级转运蛋白为，PIN-formed (PIN)蛋白，其极性决定了细胞间生长素流动的方向性。毛竹作为中国分布最广且最具经济价值的竹种，目前对于其体内PIN蛋白的认知依然较浅、研究也不深入，长生素运输在毛竹中的作用目前也不清楚。
2023年2月，国家林业和草原局北京竹藤科学技术重点实验室高健教授研究团队在International Journal of Biological Macromolecules（IF 8.025）杂志上发表了题为“Phylogeny, transcriptional profile, and auxin-induced phosphorylation modification characteristics of conserved PIN proteins in Moso bamboo (Phyllostachys edulis)”的研究论文，该研究获得了毛竹中的PIN基因，并对起进行了理化、结构分析以及系统进化树分析。同时采用转录组揭示了PIN1亚家族的调控作用、采用4D-Labelfree磷酸化修饰组发现了PIN蛋白和蛋白激酶的磷酸化过程响应生长素的调节，并构建了一个以PIN蛋白为核心的植物激素相互作用网络。中科新生命为该研究提供了4D-Labelfree磷酸化修饰组技术服务。
研究材料
不同生长时期、不同处理方式的的毛竹竹笋，毛竹不同部位的组织（叶片、花芽、根茎尖等）
研究内容
1. 毛竹PIN基因家族的鉴定、理化性质及结构分析
为了鉴定毛竹中的候选PIN基因，将拟南芥和水稻的PIN蛋白序列与毛竹基因组数据库进行比较，共得到23条PIN基因序列。对这些PIN基因家族的启动子区域、顺式作用元件和基因结构进行分析后，发现PIN家族均含有植物激素相关响应元件、光响应和myb结合元件，表明竹子的生长素转运和光信号通路密切相关，并受到MYB转录因子的调控。但是不同PIN亚家族间（PIN1、PIN2和PIN9亚家族与PIN5、PIN8亚家族）motif、结构域和外显子数量上不一致，这也导致了毛竹PIN基因的功能特异性（图1）。另外，由于PIN蛋白作为跨膜转运蛋白的特异性，其空间结构至关重要，作者分析了PIN蛋白家族的三维结构，结果发现毛竹中很多PIN蛋白均可以特异性结合生长素，揭示不同的PIN蛋白在不同时间或在不同器官负责生长素的运输（图2）。
图1 毛竹PIN基因家族成员的结构分析
图2 PIN蛋白三维结构预测分析
2. PIN基因家族的染色体分布、共向进化关系和系统发育树分析
进化过程中基因家族的扩张和收缩会影响基因结构，进而影响基因功能的分化，作者分析了毛竹PIN基因（PhePIN）家族的基因组同线群和比较共联图。研究发现分布在不同的染色体上的PIN基因的复制并导致毛竹中PIN家族基因的数量远高于水稻和拟南芥。全基因组水平上构建的水稻、玉米和马竹的比较共联图谱，发现毛竹的17个PhePIN基因与这3个物种的基因具有共线关系，表明这些基因在进化早期就出现并稳定存在。毛竹PIN基因在进化上较为保守(图3)。
图3 毛竹PIN基因的染色体分布、种内片段重复及种间共线关系
为了研究毛竹PIN基因家族的系统发育模式，作者选取了水稻、玉米、拟南芥等物种中的PIN基因、不同竹科的PIN基因分别与毛竹进行系统发育树的构建。结果显示PhePIN基因相对保守，在竹亚科内亲缘关系较近（图4A）。另外，在竹科中，由于染色体倍性变化不大，其生物学功能可能更为集中和相似（图4B）。
图4 毛竹PIN基因的系统发育树
3. 转录组学和qRT-PCR方法分析PIN基因转录水平表达模式
为了研究PIN基因家族的生物学功能，作者采用转录组学方法对不同毛竹组织（图5A）、不同生长发育阶段的竹笋（图5B）、不同处理方式的竹笋（图5C）中的PIN基因的表达模式分别进行分析。结果发现PhePIN1亚家族和PhePIN9-5基因在所有数据中均特异性的高表达，其他基因在不同发育阶段、不同组织、不同处理中均有不同程度的特异性表达。
为了确定PIN基因的表达模式，作者采用3个月大的幼苗的根、茎和叶进行了qRT-PCR (图6)。研究发现PIN1亚家族决定了不同PIN亚家族的主要调控作用，该发现证实了生长素合成与作用位点的不一致可能是由于PIN蛋白的极性转运调控。此外，对不同生长发育阶段的竹笋的上部、中部和基部进行分析，发现PIN基因在不同发育阶段处于不同的作用位置，表明生长素在快速生长期的作用位置与快速生长期之前的位置不一样。
图5 转录组学分析PIN基因的表达模式
图6 qRT-PCR验证PIN基因表达模式
4. 生长素诱导的毛竹中PIN蛋白磷酸化修饰组分析
PIN蛋白介导的生长素转运过程主要通过蛋白磷酸化级联途径产生。为研究PIN蛋白在生长素调控竹子快速生长过程中的作用，作者采用4D-Labelfree磷酸化修饰组对生长素处理的毛竹快速生长期(笋高4m)第18节间进行分析。结果发现磷酸化修饰主要发生在PIN1亚家族中的PhePIN2-1和PhePIN9-5蛋白上，多个磷酸化激酶也发生了磷酸化修饰。磷酸化修饰肽的保守motif基序分析发现在毛竹中主要的基序是[S_PxxxxK]、[xKxxxS_Pxxxx]、[xxxxxS_PxxxxxG]、[xxxxxx_S_PRxxxx]、[xxxxxs_pxxxxx]和[xxxxx_S_Pxxxxx]，与报道的motif不同。综上所述，PIN蛋白及其相关蛋白的磷酸化修饰是生长素诱导修饰的重要组成部分，PIN1蛋白亚家族在PIN蛋白中起主要的磷酸化作用。竹子的特异性决定了其保守磷酸化motif基序的差异。
图7 生长素诱导的毛竹中PIN蛋白磷酸化修饰组分析
5. 以PIN蛋白为中心的植物激素整合调控模型分析
为了研究PIN蛋白介导的激素间调节模式，作者通过同源比对鉴定了毛竹中所有已报道的植物激素家族成员及其相关蛋白激酶，然后利用获得的蛋白质序列和STRING数据库预测蛋白间互作关系以及筛选与毛竹PIN蛋白的互作蛋白（图8）。结果发现互作蛋白网络中涉及7个PIN蛋白，且PIN蛋白的调控蛋白主要集中在生长素信号通路中。脱落酸和赤霉素信号通路参与了PIN蛋白的调控。4种蛋白激酶参与PIN蛋白的相互调控。
图8 毛竹中PIN蛋白相互作用蛋白预测
小结