大脑由数百万个神经元细胞组成，了解这些神经元如何连接在一起可以更好地解析大脑的工作方式。为了更容易区分大脑中的单个神经元，通常需要一种特殊标记方法，随机标记一小部分神经元以突出它们的树突和轴突精细结构以及走向，称为稀疏标记。今天，我们盘点下几种常用的基于荧光成像的神经稀疏标记方法。
一、多色标记系统
随机多色标记方法“Brainbow”是一种可以用不同荧光蛋白对多个神经元进行差异标记，但该系统荧光亮度不足，Sakaguchi等人基于此系统，引入四环素诱导系统，称为“Tetbow”，成功增强了荧光强度，实现对神经元的标记：
是不是亮度还不够？作者进一步使用SeeDB2 作为组织清除剂，减少甘油 (SeeDB2G) 或油 (SeeDB2S) 浸没物镜的球面像差，提高3D高分辨率成像。将Tetbow系统质粒通过电穿孔引入大脑皮层的第 2/3 层神经元，树突棘的详细结构，轴突，神经元形态的精细细节都清晰地可视化
通过将不同荧光的载体混合共同注射脑部，实现不同细胞染上不同的荧光，以区分不同的神经元，再以四环素系统调整不同神经元的亮度，以实现明暗的标记对比，可以预见的是，混合的荧光类型越多，可能稀疏标记程度越高。
二、基于化学标签的成像
组织的透明度与对荧光蛋白的损伤之间存在权衡，水性组织清除剂可用于荧光蛋白的大规模三维成像。然而，要彻底清除富含脂质的有髓轴突，必须使用清洁剂、溶剂和加热等苛刻的清除处理方法，大多数基于溶剂的清除方法会导致荧光蛋白的淬灭。为了克服这个问题，作者开发出来基于SNAP、Halo、CLIP 和 TMP等化学标签的标记系统Tetbow，这些标签分子量相对较小，易于渗透到厚组织中。一旦它们与其底物形成共价键，并与合成标签一起发出荧光，即使在苛刻的透明条件下，荧光也能保持稳定。
化学标签在苛刻的清除条件下是稳定的，意味着可以有更广泛的清除方法选择，特别是对于富含脂质的厚组织。其次，与荧光蛋白相比，化学标签可以提供更多的荧光光谱和光化学特性选择。例如，合成荧光团覆盖了从紫外到近红外范围的光谱，在成像时扩大了可能的光谱范围。
三、基于MORF的稀疏成像
DNA 微卫星，如基因组中的单核苷酸重复序列，在 DNA 复制或修复过程中容易受到随机移码突变的影响。通过构建CRE依赖的荧光报告系统，在翻译起始密码子ATG与荧光蛋白之间，插入重复的碱基C，在 Cre +在细胞后代中，floxed内的转录终止序列被移除，但由于单核苷酸重复作为框架外的“翻译开关”，大多数细胞仍然无法翻译 MORF 报告蛋白，只有单核苷酸重复是3的倍数，膜结合报告蛋白才会被翻译以标记细胞形态
基于上述原理，作者构建了单核苷酸重复移码 (MORF) 作为随机平移开关赋予 Cre 依赖稀疏细胞标记的四个小鼠品系，以及引入四环素表达的改造型TIGRE-MORF，两者都能实现神经元的稀疏标记和随机表达：
该系统利用重复碱基复制时，会随机缺失作为荧光表达的开关，将荧光定位于细胞膜以标记更清楚的神经元形态，只需将报告系统做成小鼠，即可配合不同神经元启动子表达的CRE病毒或者CRE鼠杂交，即可实现不同神经元的形态标记。对于需要研究多种神经类型标记的需求，无需注射多种病毒，就能开展后续研究。
四、多AAV标记系统
罗敏敏/龚辉合作，开发了基于四环素、CRE/loxp、FLP/frt三者合一的AAV递送系统。该系统的原理是:FLP重组酶受CRE酶的诱导特异性表达，称为控制子；FLP又特异性调控GFP和rTA的表达,其中，GFP是报告系统，rTA是四环素系统的调控蛋白，其表达之后可以激活两大系统TRE启动子的表达。该系统的亮点是，不需要额外加四环素开启系统表达，而是利用TRE本身的泄露表达，自行刺激第二个病毒GFP的表达，形成正向表达反馈，因此成为放大子。
作者利用双病毒共同注射多巴胺启动子控制的CRE鼠VTA区，三周后取脑部切片，获取了十五个多巴胺神经元的投射图：
该系统也可以对单个神经元进行标记，利用retro血清型（不跨突触的逆行标记）对轴突递送CRE重组酶，将 AAV-retro-Cre 病毒注射到背侧纹状体中，双 AAV 病毒混合到皮层区域，只有同时感染上三种病毒的才得以标记，在C57BL/6 中稀疏标记了九个皮质纹状体神经元的投射老鼠，并绘制了九个神经元的网络图。
与前几种同样使用四环素系统的方法不同，该系统无需给小鼠补充诱导剂，而是利用系统本身的泄露机制实现对部分神经元的标记，与多色标记相比，有更高的分辨率。
稀疏标记的核心设计原理是实现对部分神经细胞的随机标记，而邻近细胞不标记，因此，多采取四环素系统以控制荧光表达强度，再配合本文所列的其他控制系统（多病毒竞争感染、重复碱基开关、重组酶系统）形成部分细胞荧光重新的高分辨率，当然，后期的组织样本处理也至关重要。本文重点简述稀疏标记的病毒及动物模型设计原理，各有优劣，需要考虑自身实验需求及条件选取标记系统。
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