甲基化检测
几个概念：
1，CpG岛：富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300—3000bp。这里CpG是胞嘧啶（C）—磷酸（p）—鸟嘌呤（G）的缩写。甲基化发生的重点基因区段。
2，甲基化率：指样本对应位点发生甲基化的概率。
3，甲基化处理：通过重亚硫酸盐处理将所有未甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，甲基化胞嘧啶在这个过程中保持不变。
4：转化率：甲基化处理后，三个未甲基化的内对照区段中检测到的胸腺嘧啶（T）数量与阳性标准品中胞嘧啶（C）的数量的比值。
几种甲基化检测方法：
1，Qpcr方法：通过荧光标记的目的序列，检测单个位点是否发生甲基化。
优缺点：引物设计要求高，需要加入3个QC组监测DNA量和完整性以及转化回收率和转化完整率。成本高。C经过处理后所占比例大大减少，引物和目的基因的结合稳定性大大降低。
2，一代+单克隆方法：通过一代sanger测序法，对甲基化处理后的DN**段进行测序。甲基化的样本和未甲基化的样本产生2个重叠峰，通过判断重叠峰和主峰的峰高比值计算甲基化率。
优缺点：统计样本的甲基化率时，需要对多个样本进行测序，成本大。甲基化率的判读复杂，容易受杂峰影响，比率计算不精确。通过单克隆筛选的方法可以解决该问题，带来的新的问题就是单克隆培养的周期时间和成本。
3，焦磷酸测序：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
优缺点：精确性高，可重复性好，检测速度较快，灵活性好。适用于已知的短序列的测序分析，改良后也可进行高通量测序，唯一的缺点，成本特高。
4，二代NGS测序+多重PCR：本公司解决方案，重亚硫酸盐处理后，通过自己开发的多重PCR技术，在同一管内进行多个PCR反应，降低所需DNA样本量，节约成本。二代NGS测序，解决多个样本的甲基化率检测问题，测序深度达到1000×，成本更低，测序精确性更好。使用国外进口QIAGEN凯杰试剂盒，保障样本处理的效果。15年的科研经验，不断优化实验体系，确保甲基化转化率达到99％，检出率达到95％。
优缺点:成本特低，测序精度高，检出率高，精确计算统计多个样本的甲基化率。唯一缺点，实验周期较长。适合多样本，多位点检测。
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