近年来，基因疗法已成为治疗和治愈受损心血管组织的一种有前景的方法，能够使心脏从无功能状态恢复到正常状态。AAV可在心脏组织有效、持久、稳定、安全地表达外源基因，因而在心脏基因治疗策略中占据独特优势。大量动物实验和临床数据表明，通过AAV携带治疗基因对心血管疾病如心力衰竭、心肌缺血、心肌梗死后心脏重构等均有积极效果。在使用rAAV进行心脏研究时，正确选择AAV血清型、启动子以及注射方式是实验顺利开展的必备条件。今天小V就和大家一起来学习一下AAV在心脏研究中的优化策略，以提高AAV的基因转移效率。

1、血清型的选择

AAV血清型多种多样，在心脏研究中AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9型对心脏有较好的感染效率，其中AAV8和AAV9的感染效率较优于其他血清型，AAV9 是目前公认的高效特异性靶向心脏表达的病毒载体血清型。尽管 AAV8 的感染效果也不错，但是没有AAV9 的扩散性好。临床上靶向心肌的AAV血清型一般为1，6和9型，其中AAV1和AAV6均可有效靶向心肌和骨骼肌细胞，而AAV9则更加倾向于对心肌的感染。

图1.五种AAV血清型对心脏感染效率检测

图2.不同血清型与不同病毒量感染心脏的效果图

（Prasad K et al. Gene Therapy, 2011）

2、启动子的选择

常见的广谱型启动子CMV、CAG即可在心脏中较好表达，如果特异性要求不高的话可以选择CMV启动子，其对心脏的转导效率很高。

图3. AAV9-CMV与AAV9-CBA介导的心肌中GFP表达情况（1w、3w、5w、8w）
 (■) CMV; (■) CBA.
（BD Chen et al. Clin Exp Pharmacol Physiol 2015）

若要实现目的基因在心脏中特异性表达，推荐选择心脏特异性的启动子，如cTNT、αMHC、Des、MLC2v等，其中cTNT和αMHC两种启动子应用较为广泛。

图4.cTnT启动子在心脏表达的特异性更强
（Prasad K,Xu Y, Yang Z,et al. Gene Therapy, 2011）

3、注射方式的选择

AAV在心脏的注射方式有多种，心肌原点注射、冠状动脉注射、颈静脉注射和尾静脉注射均可以将药物递送到心脏，通常文献报道较多的是心肌原点注射和尾静脉注射。

1、心肌注射 

心肌注射是通过注射器或类似装置将药物直接注入心脏组织，多采用原位多点注射方式，注射体积20μL/site，3-5点注射，通常注射的总病毒量在10E11VG以上。与血管注射相比，心肌直接注射方法特异性较强，可以实现对感兴趣区域的高效转导，但表达不均匀，只在注射部位周围的区域进行表达。

图5.心肌注射（心外膜与心内膜途径）与心包注射
（Ishikawa K,et al. Journal of Gene Medicine,2011）

 2、尾静脉注射

 是将小鼠固定后通过尾部侧面的静脉注射使药物传递到心脏。尾静脉注射易于操作，但是特异性较心肌注射稍弱，注射体积在100μL-200μL左右，由于载体在全身广泛分布，注射剂在血容量中会被稀释，所以通常需要较高的病毒滴度。

3、颈静脉注射

颈静脉注射时，在麻醉小鼠颈部做切口，并分离颈静脉，用31G针将载体注入颈静脉。此方法需要进行手术，操作要求较高，且对动物有伤害性。颈静脉注射时，所注射的病毒总量约为20μL-100uL。

 4、冠状动脉注射

冠状动脉注射又分顺行冠状动脉注射和逆行冠状动脉注射。

顺行冠状动脉注射是通过导管直接注射载体，允许具有心脏选择性的载体进行微创递送，由于其微创性该方法具有较大的优势，已广泛用于临床和实验基因治疗研究。但由于内皮细胞是载体到达心肌细胞的屏障，导致转导效率相对较低，可以小剂量的持续注入或使用一些药剂（如腺苷、组胺类、**甘油等）来增加血管床的渗透性进行改善。

图6.顺行冠状动脉注射 A、顺行注射：通过导管直接注射载体；B、使用V型聚焦系统进行顺行注射：注射的载体通过抽吸导管从冠状窦中吸出，然后再循环到冠状动脉中；C、冠状动脉阻塞的顺行注射：将载体注射到阻断冠状动脉血流的球囊远端
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

逆行冠状动脉注射是通过阻断冠状窦进行压力调节的逆向输注，相比顺行注射更加有效。然而，这种方法需要暂时中断冠状动脉血流，以消除顺行血流对压力的影响。虽然转导效率很高，但创伤较大，危险性较高。

图7.通过冠状窦逆行注射 A、逆行注射:载体在冠状动脉阻塞时注入冠状窦，冠状窦的压力由导管调节；B、冠状窦直接注射(TransAccess):利用血管内超声引导经静脉心肌穿刺，载体由微导管通过可扩张针进行注射
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

几种常用注射方式的优劣势比较