哺乳动物心脏再生能力有限，可导致心肌梗死后心力衰竭。相比之下，斑马鱼表现出显著的心脏再生能力。据报道，多种细胞类型和信号通路参与这一过程。然而，对不同细胞和信号如何相互作用和协调调节心脏再生的全面分析目前依然缺乏研究。

2022年5月18日，张岩课题组在Protein & Cell上发表了题为Single-cell transcriptome analyses of zebrafish heart development and regeneration的研究成果。

该研究首先通过基因本体(GO)分析差异表达基因(DEGs)探索了未经处理的对照组细胞的转录特征。如预期的那样，心房心肌细胞（CM-A）和心室心肌细胞（CM-V）都显示出与心肌细胞发育与功能相关。心内膜细胞（EC）与血管发育关系密切，心外膜细胞（EP）主要参与细胞外基质(ECM)的形成，为心肌细胞提供信号增殖和成熟。心外膜源性细胞（EPDC）参与了与病灶粘附和ECM形成相关基因的调控。接下来该研究对来自甲硝唑（MTZ）干预过的细胞的DEGs进行GO分析。MTZ处理的CM-A特异性激活ATP代谢，这表明心脏损伤后能量代谢增加。再生的CM-V特异性诱导心脏细胞对心脏损伤的反应和参与细胞趋化的基因也在这些细胞中上调，表明细胞迁移对损伤后的细胞再生是必要的。这些结果表明，在心脏再生过程中涉及细胞合作和信号级联的协调和编配。

图1 Tg的最大强度投影(vmhc:mCherry-NTR; amhc:EGFP)斑马鱼胚胎，显示了正常心脏发育(A)和MTZ处理后心脏再生(B)的过程。同时，t-SNE分析显示了相应发育或再生阶段的细胞分布。

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该研究中将EPDC中再生特异性的细胞簇称为再生诱导细胞(RIC)群体，为了探索RIC群体的潜在作用，基于CRISPR/Cas9基因组编辑系统的快速功能筛选策略被多次应用于该研究，对该群体中特异表达的基因进行了功能筛选。通过将Cas9蛋白与4种专门构建的gRNAs一起注入到单细胞受精阶段的胚胎中以构建特定基因敲减的突变型，在备选的10个基因中，angpt4的突变型表现出最显著的心脏再生表型。MTZ诱导后，40%以上的F0代胚胎心肌细胞表现出心脏再生障碍。由于angpt4表达的血管生成素4是一种分泌蛋白， 这表明Angpt4可能介导EPDC和其他心脏细胞类型之间的相互作用。进一步的免疫染色结果也证实了 scRNA-seq数据所显示的angpt4在斑马鱼心脏再生过程中的EPDC中被诱导表达。

图2 （A）采用CRISPR/Cas9敲除策略进行功能筛选的10个基因t-SNE图谱显示其表达模式。

（B）注射Cas9蛋白和靶向各基因的4xgRNAs后WT和马赛克斑马鱼胚胎心脏再生成功率.

为了证实angpt4在心脏再生中的重要作用，该研究构建了一个稳转突变系，该突变系带有斑马鱼angpt4位点外显子1的一个 2 bp的缺失(图3A和3B)。angpt4纯合突变胚胎发育未见明显缺陷(图3C)，成年突变体既能存活，又能繁育，心脏形态正常(图3D和3E)，表明angpt4对斑马鱼心脏发育成熟不是必需的。

图3（A）和（B）：斑马鱼angpt4基因结构及CRISPR/Cas9靶点及突变等位基因序列示意图。 在稳转突变体的angpt4中发现了外显子1存在2 bp的缺失。预测2-bp缺失的等位基因angpt4表达的部分缺失的蛋白产物。（C），（D）和（E）：稳转突变体的形态学检测结果和野生型和angpt4-/-斑马鱼胚胎心脏重(HW)与体重(BW)比值的定量结果。

与angpt4在发育过程中的非必需的作用相反，在angpt4突变型胚胎中，MTZ诱导的心室损伤后的再生在很大程度上被限制，尽管心房在形态学上保持正常。Angpt4通过下游激活Tie2-MAPK通路发挥促进心脏再生作用。 该结果揭示了EPDC和EC之间通过Angpt4-Tie2-MAPK信号通路的细胞相互作用网络，这对心脏再生至关重要。

该研究中使用的Cas9（E365）蛋白来自近岸蛋白，同时，近岸蛋白还提供系列工具酶及重组蛋白等。

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为了揭示angpt4敲除对受损心脏再生的影响的分子机制，以及angpt4-tie2-MAPK信号通路如何调控心脏再生，该研究评估了不同基因簇的表达特征。 通过检测C3和C4簇之间的差异表达基因，发现C3高表达RA信号受体rxrga (retinoid x receptor, gamma a) 及其下游基因ctsk (cathepsin K)，表明retinoic acid（RA）信号通路在心室心肌细胞中被激活，并且这种激活依赖于Angpt4 。此外，RA信号已经被证实参与肢体再生和骨形成过程中collagenase-encoding组织蛋白酶基因的表达的调节。

图4 分离的CM-V细胞的t-SNE图，显示了WT组(未处理)、MTZ处理的WT组以及MTZ处理的angpt4⁺实验组中CM-V细胞的分布。

综上所述，本文揭示了心脏再生过程中一个重要的分子和细胞协调网络，该网络由EPDC中angpt4的上调启动，导致EC中MAPK信号的激活，进一步激活RA信号、胶原降解和 CM细胞增殖，最终导致受损心脏的结构和功能完全恢复。

与野生型斑马鱼相比，angpt4过表达导致斑马鱼疤痕组织明显更小，这表明过表达angpt4可以激活pTie2和pERK信号，促进斑马鱼心脏细胞再生(图5)

图5 WT和angpt4 过表达的斑马鱼心脏组织再生情况对比

另外, ejection fraction (EF)和fractional shortening (FS)都显示与AAV9-GFP处理的对照组小鼠相比，注射AAV9-ANGPT4的老鼠在心肌梗死后心脏功能恢复明显较好，表明 ANGPT4在体内的过表达可以促进成年小鼠的心脏修复功能，而ANGPT4表达的抑制则会导致心脏损伤后的再生障碍。 总之，我们揭示了angpt4启动的EPDC-EC-CM细胞协作三种主要心脏细胞之间的网络来协调和调节斑马鱼心脏的再生(图6)。 该研究揭示了 angpt4基因在哺乳动物中是保守基因。 随着对Angpt4的核心功能和保守特征和相关细胞协调作用机制的深入了解，未来有望提升人类心脏疾病的医疗技术。

图6 EPDC-EC-CM细胞间协作联系和相关调节因子

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