酒精相关肝病（ALD）是常见的慢性肝病，经常导致肝硬化；随着发病率上升，已成为肝移植的主要适应症。ALD从酒精相关脂肪肝开始，到以肝脏炎症为特征的亚临床脂肪肝性肝炎，进而出现进行性纤维化，最终导致肝硬化。目前将近75%的ALD患者在发生失代偿期肝硬化后才被诊断，导致错过了最佳治疗阶段。肝病的准确诊断依赖活检，这会导致1%的患者出现严重并发症。而现有的非侵入性生物标志物在疾病早期准确性有限，严重减少了及时发现和干预疾病的机会。

2022年6月，马克斯·普朗克生物化学研究所Matthias Mann团队在Nature medicine（IF 50.768）上发表题为"Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease“的研究文章，作者利用DIA蛋白质组学结合机器学习算法，成功确定了三组生物标志物，可以检测显著纤维化、轻度炎症活动和任何脂肪变性。换言之，该研究标志物可检测任何肝损伤，并帮助预测患者是否具有疾病进展风险，有巨大的临床应用潜力。

研究材料

技术路线

研究结果

本研究人群来自三个队列的参与者：1）肠肝轴-ALD队列（GALA-ALD），n=459，具有随访数据的前瞻性队列（连续招募的具有有害饮酒史的患者，代表疾病早期的无症状ALD）；2）肠肝轴-健康参与者（GALA-HP），n=137。与GALA-ALD相匹配的横断面队列；3）独立ALD验证队列，n=63，来自ALD筛查研究的横断面队列。作者进一步统计了所有受试者的临床特征。

表1 参与者基线特征

2. 蛋白组学：分析肝脏病变对肝脏和血浆蛋白质组的影响

肝脏蛋白质组检测出717种独特差异蛋白（占总量化蛋白的13%）。其中658种蛋白在纤维化阶段，135种蛋白在炎症活动阶段，68种蛋白在脂肪变性阶段发生显著失调。纤维化对肝脏蛋白质组的影响最大、其次是炎症；而炎症过程中失调的所有蛋白质中84%在纤维化中失调。根据人类蛋白质图谱的注释对失调蛋白进行分组，发现随着纤维化的增加，87%注释为肝脏特异性的蛋白在肝组织中下调；相反，80%注释为分泌的蛋白质被上调。在纤维化阶段最相关的前20种蛋白中，主要是肝脏分泌的蛋白（如TGFBI 和 EMILIN1），纤维化相关蛋白（如IGFBP7和 TNXB）。此外，前20种验证相关蛋白中约50%是细胞骨架蛋白，指征了炎症过程中肝脏细胞结构变化。而脂滴蛋白PLIN2和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）可作为NAFLD47患者从单纯脂肪变性变向非酒精性脂肪肝炎的预测标志物，与肝脂肪变性相关的系数分别排在第1和第16位。

图1 肝脏病变导致肝脏蛋白质重塑

血浆蛋白质组检测发现，共225种蛋白在纤维化阶段（206种）、炎症活动（163种）和脂肪变性（48种）的组织学阶段发生显著变化。其中，随着纤维化阶段增加，134中蛋白上调、91中下调。在注释为肝脏特异性或分泌的失调蛋白中，分别发现83%和64%被下调。下调的簇包含参与补体系统蛋白、凝血级联反应相关蛋白、载体蛋白和和载体蛋白。相关性分析显示，分别有106种、55种和5种蛋白与纤维化、炎症和脂肪变性相关。其中补体成分C7、QSOX1和LGALS3BP与纤维化程度相关性最高（也是前三个与炎症相关蛋白），具有纤维化和炎症标志物潜力。

图2 肝脏病变重塑了血浆蛋白质组

3. 数据分析：肝脏和血浆蛋白质组学数据整合

肝脏和血浆中总共有420种蛋白质被量化， 他们在二维空间中的水平表现出双模态模式。其中一组蛋白质，肝脏和血浆的相对丰度排名在很大程度上是相关的 （“对角聚类”），而另一组没有相关性（“垂直聚类”）。相关性分析显示，112种蛋白在肝脏和血浆样本之间存在显著关联。肝脏和血浆蛋白质组的协方差分析中找到46种共调控蛋白，功能涉及免疫和炎症反应、细胞粘附、ECM组织、蛋白酶抑制剂和细胞内酶等。

图3 肝脏-血浆蛋白质组整合

4. 机器学习：ALD早期病理学生物标志物

作者比较了22种机器学习分析方法，并确定逻辑回归模型作为最终分类器。作者选定三组标志物分别识别显著纤维化（9种蛋白）、轻度炎症活动（6种蛋白）和任何程度的肝脂肪变性（6种蛋白）。在包含三组标志物的22个蛋白中，有8种在血浆和肝脏中受到协同调节，包括 C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN 和 SERPINF1。重要的是，这三组标志物对显著纤维化（AUC=0.90，95% CI=0.899–0.905）、轻度炎症（AUC=0.85，95% CI 0.851–0.858）和脂肪变性（AUC=0.91，95% CI 0.907– 0.915）均有很好的诊断效能，且优于现有的15项临床测试模型。

图4 基于血浆蛋白质组的纤维化、炎症和脂肪变性预测模型

5. 独立队列验证模型性能

验证结果显示，在健康对照组（n=136）中，该模型正确排除了显著纤维化、晚期纤维化和轻度炎症，其准确率分别是99%、100%和98% ，约15%的个体被归为脂肪变性阳性，与他们BMI与ALD队列一致相关。此外，在有酒精滥用史且由于肝硬度低而未进行活检的患者子集（n=97）中，该模型排除显著和晚期纤维化的准确率分别是93%和100%。接着，作者在独立的ALD队列（n=63）中进行验证，显著纤维化和轻度炎症的模型效能高于其他同类模型，ROC-AUC分别是0.87和0.81。更重要的是，显著纤维化的蛋白组学模型相比于现有标志物，对患者肝脏相关事件（LRE）具有最高的判别准确率（Harrell's C  = 0.900 ，3年和5年AUC分别是 0.945和0.933）；对于全因死亡率，蛋白组学模型也表现最好（Harrell's C  = 0.789、3 年和 5 年 AUC 分别 = 0.836 和 0.818）。

图5 模型性能验证和预测能力评估

小编小结