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Western Blotting 实验流程
一、概述
1.组织取材：组织块称重
2.利用液氮、研钵粉碎组织块
3.加入RIPA 缓冲液（每克组织3ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），
利用Polytron 进一步匀浆（15,000 转/分*1 分钟）维持4℃
4.加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30 分钟
5.移入离心管4℃，约20,000g（约15,000 转）15 分钟
6.上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
7.进行Bradford 比色法测定蛋白质浓度
8.取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
9.沸水浴中3 分钟
10.上样
11.电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
12.电转膜仪转膜（100mA 40 分钟）
13.膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
14.Westernblot 试剂盒显色
15.分析比较记录
二、Western Blotting 具体实验步骤
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋
白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份
蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，
需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度
测定方法。
2.电泳(Electrophoresis)
（1）SDS-PAGE 凝胶配制
（2）样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。例如2X 或5X 的
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。使用5X 的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在
相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
（3）上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE 胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效
果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常推
荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于
Bio-Rad 的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在
120V 左右。SDS-PAGE 可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了电泳方便起见，也可
以采用整个SDS-PAGE 过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90
－120 分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附
近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适
当分离后即可停止电泳。
3.转膜(Transfer)
我们推荐在Western 实验中选用PVDF 膜。**纤维素膜(NC 膜)或PVDF 膜（二氟化树脂
膜膜孔径：0.45um)也可以使用，但**纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取
等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。具体的转膜时间要根据目的蛋
白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需
要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现
象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量
标准，通常分子量最大的1-2 条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对
膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的
SDS-PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
4.封闭(Blocking)
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western 洗涤液中，漂洗1-2 分钟，以洗去
膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易
产生较高的背景。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western 封闭液，在摇床上缓慢摇动,
室温封闭60 分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃ 封闭过夜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western 一抗稀释液稀释一抗。
用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动
孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加
入Western 洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，
洗涤5-10 分钟。共洗涤3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
参考二抗的说明书，按照适当比例用Western 二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的
二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓
慢摇动孵育一小时。回收二抗，加入Western 洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10 分
钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10 分钟。共洗涤3 次。如果结果背景较高可以
适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
7.蛋白检测(Detection of proteins)
参考相关说明书，使用BeyoECL, Western 荧光检测试剂等ECL 类试剂来检测蛋白。
洗片时可以使用X 光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配
制显影液和定影液进行手工洗片。
8、膜的重复利用(Membrane recovery)
如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
三、实验注意事项
1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到**纤维膜上；
a. 转移缓冲液洗涤凝胶和**纤维素膜，将**纤维素膜铺在凝胶上，用5ml 移液管在凝
胶上来回滚动去除所有的气泡
b. 在凝胶/滤膜外再包一张3mm 滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿
润和没有气泡
c. 将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极
d. 将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶
e. 按照厂家所示接通电源开始电泳转移
f. 转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶
2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置；
3.用100ml 水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液；
4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1 小时；
5.室温下，用PBS-Tween 缓冲液洗涤薄膜
6.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气；
7.袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧；
8.混合：NGS(100 微升)，印迹缓冲液中的抗体（2.5-5 毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下
摇动2 小时（或4℃过夜）；
9.用总体积300ml PBS-Tween 缓冲液，分4 次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml；
10.将连接生物素的羊抗兔IgG（40 微升溶于10 毫升印迹缓冲液/100 微升 NGS）加在袋内，
于室温下摇动1 小时；
11.按步骤9 洗涤；
12.加入抗生素蛋白-HRP（40 微升溶于10 毫升印迹缓冲液/100 微升 NGS），于室温下摇动；
13.Western Blot 中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位
的抗体不能用于Western Blot 检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的
所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行Western Blot。实验中取胶和膜需带手套。